INK (2013-10-07 16:38:40)
MBP特异性很好，所以感觉像是降解了
破菌的时候有没有加EDTA, PMSF之类的蛋白酶抑制剂？
changlhsyo (2013-10-07 16:39:08)
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原帖由 INK 于 2013-10-7 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
MBP特异性很好，所以感觉像是降解了
破菌的时候有没有加EDTA, PMSF之类的蛋白酶抑制剂？ 您好，EDTA加了，PMSF没有加。但是从跑胶的结果看，感觉目的蛋白没有被降解。我的目标蛋白是92KDa，在那个位置的蛋白还是很浓的。我感觉问题是这个蛋白挂不上resin。因为经过与resin的结合之后，流出来的液体跑胶蛋白还是跟超声波之后得到的上清液的结果差不多。是否形成高级结构，导致mbp没有暴露出来导致不能结合？
INK (2013-10-07 16:39:36)
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原帖由 changlhsyo 于 2013-10-7 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
您好，EDTA加了，PMSF没有加。但是从跑胶的结果看，感觉目的蛋白没有被降解。我的目标蛋白是92KDa，在那个位置的蛋白还是很浓的。我感觉问题是这个蛋白挂不上resin。因为经过与resin的结合之后，流出来的液体跑胶蛋白还是跟 ... MBP是个42kDa而且极度亲水的大标签，被包被的可能性很小。一般挂不上有两个原因：
1. 缓冲液里盐浓度太高（>1M）
2. 缓冲液里有强去污剂如SDS，或者是有咪唑/尿素/盐酸胍之类的强电解质
3. 目标蛋白和MBP形成了胶束状结构
前两个好排除，后者一般能肉眼看出破菌后的上清很浑浊，高速离心1-2小时才能澄清，底部的沉淀是黄色果冻状
如果还是不行可以考虑把Linker加长或者把MBP放到C端去，但是这种可能性也不大。
changlhsyo (2013-10-07 16:40:02)
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原帖由 INK 于 2013-10-7 16:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
MBP是个42kDa而且极度亲水的大标签，被包被的可能性很小。一般挂不上有两个原因：
1. 缓冲液里盐浓度太高（>1M）
2. 缓冲液里有强去污剂如SDS，或者是有咪唑/尿素/盐酸胍之类的强电解质
3. 目标蛋白和MBP形成了胶束状结构
... 谢谢您的回答
1 我的盐浓度是200mM
2 缓冲液是没有SDS之类的
3 这个蛋白相对于另外一个蛋白，超声的难度要高些，同样的条件，这个蛋白澄清的程度要低于另外一个蛋白。
我离心12000rpm/5min基本就可以得到上清了
INK (2013-10-07 16:40:28)
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原帖由 changlhsyo 于 2013-10-7 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
谢谢您的回答
1 我的盐浓度是200mM
2 缓冲液是没有SDS之类的
3 这个蛋白相对于另外一个蛋白，超声的难度要高些，同样的条件，这个蛋白澄清的程度要低于另外一个蛋白。
我离心12000rpm/5min基本就可以得到上清了 ... 眼睛所见的上清并不一定可溶，再离心30分钟试试看吧。没有充分离心的上清应该很难通过0.22um的滤膜
yychen (2013-10-07 16:41:09)
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原帖由 changlhsyo 于 2013-10-7 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
各位做蛋白纯化的前辈们，偶是做蛋白纯化的新手。花了很长的时间去诱导蛋白在上清中表达，遇到很多的问题，然后到了纯化这一步，又遇到了棘手的问题。望请各位指点。
我的蛋白的标签是MBP，买的是NEB的amylase resin 由于说明 ... 你的图片没有标明确哪条lane是做什么的。如果左边marker边上2条是细胞裂解液，中间4条是洗脱流出液，那么蛋白的确结合上柱子了。但不知道右边6条lanes又是什么呢？
changlhsyo (2013-10-07 16:41:38)
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原帖由 yychen 于 2013-10-7 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
你的图片没有标明确哪条lane是做什么的。如果左边marker边上2条是细胞裂解液，中间4条是洗脱流出液，那么蛋白的确结合上柱子了。但不知道右边6条lanes又是什么呢？ ... 不好意思，写得不够详细
这块胶跑的是两个蛋白。左边1 Marker 2 上清液 3 incubate之后的上清液 4 buffer 洗脱之后的液体 5 elute 的液体（一共洗了三次）
右边是另外一个蛋白 顺序也是一样的
yychen (2013-10-07 16:42:05)
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原帖由 changlhsyo 于 2013-10-7 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
不好意思，写得不够详细
这块胶跑的是两个蛋白。左边1 Marker 2 上清液 3 incubate之后的上清液 4 buffer 洗脱之后的液体 5 elute 的液体（一共洗了三次）
右边是另外一个蛋白 顺序也是一样的 ... 你是怎么结合的？
过柱一遍肯定是不行的。起码3遍吧。
比较完全的办法是把蛋白和柱子放在管子里，4度振荡孵育2小时至过夜。你可以在1小时以后分几个时间点取一些上清跑western，看看你的目的蛋白有没有结合上。
另外你的柱子平衡也很重要。
还有就是确保使用的蛋白提取液里不含有与amylose resin不兼容的物质。
changlhsyo (2013-10-07 16:42:55)
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原帖由 yychen 于 2013-10-7 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
你是怎么结合的？
过柱一遍肯定是不行的。起码3遍吧。
比较完全的办法是把蛋白和柱子放在管子里，4度振荡孵育2小时至过夜。你可以在1小时以后分几个时间点取一些上清跑western，看看你的目的蛋白有没有结合上。
另外你的 ... 谢谢您的回答。我有几点疑惑想请教您
1 您说的过柱是指elute这步要3遍还是指其他的？elute这步洗脱的体积应该是多少？加入多会减少非特异带吗？
2 孵育我是按照说明书上面写着1H ,后来我尝试着孵育2~3H.跑western可以检测蛋白结合了吗？
3 柱平衡我是加了一点五倍的缓冲液和一点五倍的水，然后振荡5min，洗了两次
4 我是用超声的方法提取蛋白的。所用的缓冲液都按照NEB上面提供配置的，应该会与resin兼容
yychen (2013-10-07 16:43:24)
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原帖由 changlhsyo 于 2013-10-7 16:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
谢谢您的回答。我有几点疑惑想请教您
1 您说的过柱是指elute这步要3遍还是指其他的？elute这步洗脱的体积应该是多少？加入多会减少非特异带吗？
2 孵育我是按照说明书上面写着1H ,后来我尝试着孵育2~3H.跑western可以检 ... 1 我的过柱指的是结合。洗脱你得根据洗脱出的蛋白峰来决定多少体积。
2 孵育2-3小时应该是可以的。但是根据你的平衡柱子的方法，可能平衡不太够，所以还是结合不上。 你把细胞裂解液、洗液放在一起跑个western，就知道有多少结合在柱子上了。
3 根据你的平衡方法，可能使用的缓冲液太少了。我一般用10倍柱体积的缓冲液洗2次。
4 如果缓冲液兼容，那应该没问题。